引言

二氢生物蝶呤还原酶（Dihydropteridine Reductase, DHBPR）是四氢生物蝶呤（BH4）再生途径中的关键酶，在苯丙氨酸羟化酶（PAH）的催化反应中起重要作用。BH4作为多种芳香族氨基酸羟化酶的辅因子，其代谢异常可导致高苯丙氨酸血症及神经递质合成障碍，进而引发苯丙酮尿症（PKU）等遗传代谢疾病。DHBPR的活性检测对先天性代谢缺陷的早期诊断、分型及治疗监测至关重要。本文将从检测范围、检测项目、检测方法及仪器等方面，系统阐述DHBPR检测的临床应用与技术进展。

检测范围

DHBPR检测主要应用于以下场景：

• 新生儿筛查：通过检测血液样本中的酶活性，早期发现BH4代谢缺陷型PKU；
• 临床诊断：针对高苯丙氨酸血症患者的病因分型，区分经典PKU与BH4缺乏症；
• 遗传咨询：对有家族史的高危人群进行基因携带者筛查；
• 药物疗效监测：评估BH4替代治疗后的酶活性恢复情况。

检测项目

DHBPR检测的核心项目包括：

• 酶活性测定：通过体外反应体系测定酶催化NADPH生成的能力；
• 基因突变分析：对DHBPR基因（QDPR）进行测序，识别致病性变异；
• 代谢物浓度检测：评估血液或尿液中苯丙氨酸、生物蝶呤及神经递质前体的水平；
• 功能验证实验：通过细胞模型验证突变对酶活性的影响。

检测方法

根据检测目标的不同，DHBPR检测主要采用以下方法：

1. 分光光度法（酶活性检测）

基于DHBPR催化反应中NADPH浓度变化的原理，通过分光光度计在340 nm波长处测定吸光度变化速率。具体步骤包括：

• 样本预处理：红细胞裂解后提取酶粗提液；
• 反应体系配制：加入反应缓冲液、底物二氢生物蝶呤（DHB）及NADPH；
• 动力学监测：连续记录吸光度变化5分钟；
• 结果计算：根据ΔA/min计算酶活性单位（U/g Hb）。

2. 分子生物学技术（基因检测）

采用Sanger测序或二代测序（NGS）对QDPR基因外显子及剪切位点进行检测：

• DNA提取：从外周血白细胞中分离基因组DNA；
• PCR扩增：设计特异性引物扩增目标区域；
• 序列比对：通过生物信息学分析识别错义突变、无义突变或剪切位点变异；
• 功能预测：使用PolyPhen-2等工具评估突变致病性。

3. 液相色谱法（代谢物检测）

通过反相色谱柱分离血浆中的苯丙氨酸与生物蝶呤衍生物，结合荧光检测器实现定量分析：

• 样本去蛋白化：使用三氯乙酸沉淀蛋白质；
• 色谱条件：C18色谱柱，流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液梯度洗脱；
• 检测参数：激发波长350 nm，发射波长450 nm；
• 标准曲线法计算代谢物浓度。

检测仪器与试剂

DHBPR检测需配套设备与标准化试剂：

• 分光光度计：如Thermo Scientific Multiskan SkyHigh，可进行高精度动力学检测；
• PCR仪与测序仪：ABI 3500系列基因分析仪适用于Sanger测序；
• 液相色谱仪：Agilent 1260 Infinity II配备荧光检测器；
• 试剂盒：商业化DHBPR活性检测试剂盒（含DHB底物、NADPH及反应缓冲液）。

检测的临床意义

DHBPR检测在以下方面具有重要价值：

• 鉴别诊断：BH4缺乏症患者需及时补充BH4，而经典PKU需低苯丙氨酸饮食；
• 预后评估：残余酶活性＞5%的患者神经损伤风险较低；
• 治疗优化：动态监测酶活性可调整药物剂量，避免BH4过度累积；
• 遗传阻断：明确致病突变可为产前诊断提供依据。

结论

DHBPR检测是BH4代谢障碍性疾病诊疗体系的核心环节，整合酶学、基因与代谢物分析可显著提升诊断准确性。随着微流控芯片、质谱联用技术的发展，未来检测将趋向高通量、自动化与精准化。临床实践中需严格规范样本处理流程，结合多学科协作制定个体化管理方案，以改善患者长期预后。

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